Хроматография на хидрофобна колона

Хроматография на хидрофобна взаимодействие(HIC) е мощна техника, използвана предимно в разделянето и пречистването на протеините, особено тези, които притежават хидрофобни свойства. Този хроматографски метод използва диференциалните хидрофобни взаимодействия между молекулите на пробата и стационарната фаза, което позволява разделянето на компонентите въз основа на скоростта на миграцията им по време на елуирането с подвижната фаза. В тази цялостна статия ще се задълбочим в принципите, експлоатацията, приложенията, предимствата, недостатъците и скорошните напредъци на хидрофобната взаимодействие хроматография.

Основата на HIC се намира в хидрофобните взаимодействия между протеиновите молекули и хидрофобните лиганди, прикрепени към стационарната фаза. Протеините, които са амфипатични по природа, съдържат както хидрофилни, така и хидрофобни остатъци. Във водни разтвори хидрофилните остатъци са склонни да се сблъскват навън, взаимодействащи с водни молекули, докато хидрофобните остатъци често се погребват в третичната структура на протеина. Въпреки това, при определени условия, като наличието на високи концентрации на сол, тези хидрофобни остатъци могат да станат изложени, насърчавайки взаимодействието им с хидрофобните лиганди върху хроматографската матрица.

Мобилната фаза в HIC обикновено се състои от буфериран разтвор на физиологичен разтвор с диапазон на рН 6-8. Използват се високи концентрации на сол за засилване на хидрофобните взаимодействия, улесняване на свързването на протеините до стационарната фаза. Постепенното намаляване на концентрацията на сол в подвижната фаза по време на елуирането увеличава мощността на измиване, което позволява да се елуира протеините въз основа на тяхната хидрофобност. Протеините с по -слаби хидрофобни взаимодействия се елуират първо, последвани от тези с по -силни взаимодействия.

Методологията на хроматографията на хидрофобната колона включва няколко важни етапа, включително приготвяне на проби, уравновесяване на колоните, зареждане на пробата, елуиране и събиране на фракции.

◆ Подготовка на пробата:
Преди да заредите пробата върху колоната, е от съществено значение да се приготви пробата, като добавите достатъчно сол, за да съответства на концентрацията на сол на подвижната фаза А (равновесен буфер). PH на разтвора на пробата също трябва да се регулира, за да отговаря на условията на адсорбция.

◆ Колоново равновесие:
Колоната се уравновесява с подвижна фаза А, която е буфериран разтвор на физиологичен разтвор на специфично рН и концентрация на сол. Това гарантира, че стационарната фаза е наситена с буфера, готова за взаимодействие с протеините на пробата.

◆ Зареждане на пробата:
Приготвената проба се зарежда върху колоната. Обемът на пробата се влияе от концентрацията на компонента и свързващия капацитет на средата. За разредени проби е възможно директно натоварване без предварителна концентрация.

◆ Елуиране:
Елуирането се постига чрез постепенно намаляване на концентрацията на сол на подвижната фаза, като по този начин отслабва хидрофобните взаимодействия между протеините и стационарната фаза. Алтернативно, елуирането може да бъде постигнато чрез добавяне на органични разтворители или почистващи препарати към подвижната фаза, за да се промени полярността му или да се измести свързаните протеини.

◆ Колекция от фракции:
Елуираните фракции се събират и анализират за оценка на чистотата и възстановяването на целевите протеини.

Няколко фактора влияят значително на ефективността на разделянето и чистотата на протеините в хроматографията на хидрофобните колони:

◆ Концентрация на сол и тип:
Типът и концентрацията на сол в подвижната фаза играят основна роля в модулирането на хидрофобни взаимодействия. Обикновено се използват соли като амониев сулфат и натриев хлорид, като концентрациите варират от 0. 75 до 2 mol/L за амониев сулфат и 1 до 4 mol/L за натриев хлорид.

◆ ph:
PH на подвижната фаза влияе върху състоянието на заряда и хидрофобността на протеините. PH далеч от изоелектричната точка на протеина има тенденция да благоприятства елуирането чрез намаляване на хидрофобните взаимодействия.

◆ Температура:
Повишаването на температурата на колоната може да повиши хидрофобните взаимодействия, което води до подобрена ефективност на разделянето.

◆ Дебит:
Дебитът влияе върху времето на пребиваване на протеините в колоната, което влияе върху тяхното взаимодействие със стационарната фаза.

◆ Характеристики на колоните:
Дължината, диаметърът и материалът за опаковане на колоната допринасят за ефективността на разделянето. Изборът на стационарен фазов материал и неговите повърхностни свойства също са от решаващо значение.

HIC намира широко приложение при пречистването на различни протеини, включително серумни протеини, свързани с мембрана протеини, ядрени протеини, рецептори и рекомбинантни протеини. Нежните му условия за разделяне го правят особено подходящ за пречистване на активни вещества, като ензими, антитела и други терапевтични протеини.

Предимства:

1) Високи степени на възстановяване: HIC предлага високи скорости на възстановяване на протеините, което го прави ефективен за мащабни процеси за пречистване.

2) Поддържана активност на протеина: Леките условия на разделяне минимизират денатурирането на протеини и загубата на активност.

3) Универсалност: HIC може да бъде адаптиран за пречистване на широк спектър от протеини с различни хидрофобни свойства.

Недостатъци:

1) Ограничена разтворимост: Някои протеини могат да проявяват намалена разтворимост при високи концентрации на сол, ограничавайки тяхната приложимост в HIC.

2) Солна намеса: Високите концентрации на сол в подвижната фаза могат да попречат на последващи аналитични стъпки, налагащи допълнителни процедури за обезсоляване.

Последните напредък в HIC се фокусират върху разработването на нови хроматографски матрици с повишена ефективност на разделяне и стабилност. Включването на принципите на хидрофилна взаимодействие (HILIC) и използването на смоли със смесен режим разшири приложимостта на HIC до разделянето на полярните съединения.

Нещо повече, интегрирането на HIC с други хроматографски техники, като йонообменна хроматография или хроматография с изключване на размера, улесни разработването на по-ефективни и стабилни протоколи за пречистване. Напредъкът в автоматизацията и високопроизводителните скринингови технологии също допринесоха за мащабируемостта и възпроизводимостта на HIC процесите.

Бъдещите направления в HIC изследванията включват изследване на алтернативни лиганди и матрици за по -нататъшно подобряване на ефективността на разделянето и разширяване на обхвата на приложенията. Разработването на по-екологични и устойчиви мобилни фази, както и оптимизирането на условията на елуиране, за да се сведе до минимум денатурирането на протеини, остават области на текущи изследвания.

В заключение, хидрофобната взаимодействие хроматография представлява универсален и ефективен инструмент за разделяне и пречистване на протеини, особено тези с хидрофобни свойства. Чрез използване на диференциалните хидрофобни взаимодействия между молекулите на пробата и стационарната фаза, HIC дава възможност за пречистване на висококачествени протеини за различни терапевтични, диагностични и изследователски приложения. С постоянния напредък в хроматографските материали, автоматизацията и интеграцията с други техники, бъдещето на HIC обещава още по -голяма ефективност и по -широка приложимост в областта на биофармацевтичните продукти.

Популярни тагове: Хроматография с хидрофобна колона, China Hydrophobic Column Chromatography, доставчици, фабрика